鱼类脂肪酸提取及甲酯化虚拟仿真实验教学

王少琴^1,2 ，胡  松^1,3    

（1.上海海洋大学 海洋科学学院 上海 201306；2.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室 上海海洋大学 上海 201306；3.上海海洋大学海洋科学与技术实验教学示范中心 上海海洋大学 上海 201306）

[摘  要]鱼类脂肪酸数据测定在鱼类营养学及水生生态系统上有重要作用。鉴于在鱼类脂肪酸实验教学中，大量的重复有机化学试验会导致实验耗材的大量损耗且危及学生的人身安全，因此采用虚拟仿真方法建设鱼类脂肪酸提取及甲酯化操作过程，促进教学过程中原理与操作相结合，提高增强教学过程中学生的兴趣和实际操作可观性。

[关键词]虚拟仿真；脂肪酸提取；脂肪酸甲酯化

[基金项目]2019上海海洋大学一流本科实践教学平台建设项目——鱼类脂肪酸提取及甲酯化虚拟仿真实验（项目编号：A1-2023-18-0003）阶段性成果。

[作者简介]王少琴（1990-），女（汉族），安徽安庆人，上海海洋大学海洋科学学院工程师，研究方向为鱼类摄食生态学。

[通讯作者]胡松（1978-），男（汉族），安徽祁门人，上海海洋大学海洋科学学院副院长，主要分管本科教学工作，研究方向为物理海洋学。

[中图分类号] G642    [文献标识码] A  

一、问题的提出

脂肪酸是由碳、氢、氧三种元素组成的一类有机物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。脂肪酸根据碳氢链饱和与不饱和的不同可分为三类，即：饱和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA），碳氢上没有不饱和键；单不饱和脂肪酸（Monounsaturated fatty acids，MUFA），其碳氢链有一个不饱和键；多不饱和脂肪（Polyunsaturated fatty acids，PUFA），其碳氢链有二个或二个以上不饱和键。营养学和生物临床医学研究认为，脂肪酸在维持人体健康方面具有重要作用，尤其是多不饱和脂肪酸，能够保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能；使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯；降低血液粘稠度，改善血液微循环；提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力^[1-2]。

鱼油中含有较丰富的多不饱和脂肪酸，如我们平时说的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸(DHA和EPA)。因此研究鱼类脂肪酸含量，一方面有助于评估鱼类的营养价值^[3-4]，另一方面。了解鱼类脂肪酸含量有助于研究鱼类的摄食状况，进而在了解水生生态系统方面具有重大作用^[5]。由于鱼类脂肪酸提取和甲酯化实验过程操作复杂，需要用到大量的有机化学试剂，因此在教学过程中实验耗时长（一个实验过程大约要2-3天才能完成），实验耗材和试剂损耗量大，且具有一定的危险性，因此传统教学中无法满足每个学生都能进行鱼类脂肪酸测定实验的操作需求。虚拟仿真实验教学是通过动画与计算机模拟，构建高度仿真的虚拟实验环境和实验对象，因此虚拟仿真实验教学，降低了实验安全风险和实验成本^[6-7]。虚拟仿真实验已经成功应用于多领域教学实践中，如环境复杂多变的物理海洋学实践教学中^[8-9]。本实验将鱼类脂肪酸提取及甲酯化操作步骤以虚拟仿真建设呈现，旨在让学生了解鱼类脂肪酸提取和甲酯化原理，学习脂肪酸的提取方法，熟练脂肪酸甲酯化步骤。

上海海洋大学的海洋资源与环境专业学生主要学习生物学、水域环境学的基本理论；掌握生物资源调查评价、增殖与保护，海洋环境监测与评价，海洋与渔业管理等方面的基本知识和技能；接受有关生物学和化学的实验技能、生物资源增殖、资源与环境调查实践性环节、计算机应用能力等方面的训练，具有生物资源调查评价、增殖保护，海洋环境监测与保护、海洋与渔业管理等方面的基本能力和素质。在培养人才过程中，《渔业资源生物学》、《海洋生物学》、《海洋生态学》、《鱼类硬组织分析方法与数据应用》、《海洋环境生态学》、《海洋生物化学》和《海洋生物地球化学》等课程均需要进行脂肪酸的提取，要求学生熟练掌握脂肪酸甲酯化步骤。

 

二、鱼类脂肪酸提取及甲酯化实验目的和设计原理

实验目的：

 

鱼类脂肪酸提取及甲酯化虚拟仿真实验的主要设计目标是满足海洋资源与环境等本科专业实验教学以及部分研究生课程教学的需要，是对相关专业理论教学的补充。虚拟仿真实验设计以更加生动及感知的呈现方式，使学生可以以实际理论与虚拟对象进行自由的交互，让学生了解鱼类脂肪酸提取和甲酯化原理，学习脂肪酸的提取方法，熟练脂肪酸甲酯化步骤，达到探索学习、协同学习的目的，使其能够获得真实的体验。

 

 

设计原理：

 

鉴于脂肪酸的沸点高，高温下不稳定易裂解，分析中易造成损失，因此对脂肪酸组分分析时，先将脂肪酸与甲醇反应，制备脂肪酸甲酯，降低沸点，提高稳定性，然后进行气相色谱分析。本实验利用三氯甲烷-甲醇法提取脂肪酸，然后用三氟化硼甲醇法将脂肪酸进行甲酯化。

三氯甲烷-甲醇法提取脂肪酸的实验原理：脂肪是甘油和脂肪酸组成的脂类化合物，能溶于脂质；根据相似相溶原理，选择三氯甲烷-甲醇溶液溶解有机物组织中的脂类物质，从而分离出粗脂肪。再利用氢氧化钾-甲醇溶液脱去甘油，生成脂肪酸。

三氟化硼甲醇法进行脂肪酸甲酯化的原理：由于脂肪酸不容易气化，因此测定时需先进行甲酯化以降低沸点。利用三氟化硼甲醇溶液作为催化剂，加速脂肪酸甲酯化反应。

 

三、鱼类脂肪酸甲酯化虚拟仿真建设过程

鱼类脂肪酸提取及甲酯化虚拟仿真实验主要依托上海海洋大学国家远洋渔业工程技术研究中心、大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室及海洋科学与技术教学示范中心等实体教学和科研平台，以鱼类营养学和摄食生态学研究专业为背景，借助现代化计算机和物联网等技术，实现对鱼类脂肪酸提取和甲酯化真实过程进行虚拟化呈现，达到虚实结合和相互补充的学习效果。

 

1. 建设模块

本虚拟仿真项目包含4个基本模块：实验目的、实验原理、课后巩固和实验步骤，具体模块界面如下图1所示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1. 脂肪酸提取及甲酯化虚拟仿真实验模块图

 

(1) 操作前准备

实验开始前呈现本实验所需所有化学试剂、耗材、电子天平和高速冷冻离心机等小型仪器设备，以及准备好已经冷冻干燥并磨成粉末状的鱼类肌肉组织样本。虚拟仿真实验设置鼠标放置在试剂和耗材图标上，就能显示该试剂或耗材的专业名称以及在本次实验中的作用，使学生深刻了解本实验过程的认识及实验原理的理解。

 

(2) 实验过程

脂肪提取

打开天平电源开关，打开天平，放置称量纸，关闭天平，按去皮。打开天平，用称量勺取适量粉末于称量纸中，关闭天平，读数，待天平显示数字稳定时再打开天平，将称量纸中的粉末倒至离心管中，贴好标签。用移液枪取适量配置好的三氯甲烷－甲醇溶液，加入装有粉末的离心管中，轻轻摇晃均匀并静置,待 20 h 以后再进入下一步操作。

样品静置以充分溶解肌肉组织中的总脂后，此时脂肪酸溶解于三氯甲烷－甲醇溶液中，需离心提取上清液。具体操作是，打开冷冻离心机开关，调节转速至5000，调节时间为10分钟，打开离心机上盖，将浸泡的样品放入冷冻离心机中，点击开始按钮进行冷冻离心。待离心完成后打开离心机，取出离心管，将上清液倒入干净的离心管中。

用移液枪取适量提前配置好的 0.9 % 的氯化钠溶液于上清液中，静置约2 h后出现化学分层，用移液枪取下层溶液于干燥的圆底烧瓶中。将圆底烧瓶放置于氮吹仪平板上，打开氮吹仪气阀，打开压力阀，进行氮吹蒸发，约1 h后吹干，得到圆底烧瓶底部黄色部分即为总脂。

 

脂肪酸甲酯化

在圆底烧瓶中加入适量已经配置好的0.5 Mol/l的氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀后用夹子夹住圆底烧瓶连接水域回流装置（水域回流装置由水浴锅、冷凝管和导水管组成，冷凝管下进上出以达到对圆底烧瓶中的样品冷凝的效果），水浴加热5-10分钟。加入适量三氟化硼甲醇溶液煮沸25-30分钟。取适量正己烷加入圆底烧瓶中回流萃取2分钟。取出圆底烧瓶，快速加入适量饱和氯化钠溶液，充分摇晃混合后倒入干净消毒的离心管中，静置分层10-15分钟。待液体分层后，上层为溶解脂肪酸甲酯的正己烷层，用注射器吸取一定量的上层正己烷层，用滤膜过滤后移入2 ml的进样瓶中。将进样瓶用标签纸标好样品名称及编号以待进仪器测样。

 

 

(3) 课后巩固

课后练习是为巩固学习效果而安排的检测办法，是教学过程的重要组成部分。本虚拟仿真实验设计了鱼类脂肪酸提取和甲酯化实验理论和实验操作过程的课后练习题，用于巩固和检测本虚拟仿真实验教学效果，使学生更进一步掌握实验原理等理论知识。

 

2. 实验流程图

              鱼类脂肪酸提取和甲酯化虚拟仿真实验流程图的呈现主要是为了让学生对脂肪酸提取和甲酯化的步骤有整体的感观认识，具体流程图2如下所示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图2. 脂肪酸提取及甲酯化实验步骤

 

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四、结束语

虚拟仿真实验教学是通过动画与计算机模拟，构建高度仿真的虚拟实验环境和实验对象，通过形象化描述抽象内容^[10]，提升教学的直观性，提高学习效果。高校虚拟仿真实验教学在人才培养、科学研究、学科建设和产学研合作方面具有不可替代的作用。脂肪酸提取与甲酯化虚拟仿真实验教学，从实验本身来说，可将抽象深奥的化学理论知识变得具体形象，变色和分层的化学反应过程让学生肉眼可见，有利于培养学生将理论知识转化为实践动手能力。从安全性上说，降低了实验安全风险和实验成本，降低实验教学中的危险程度，使学生参与实验的同时保证其安全性。

新世纪高校人才培养着重从信息化与教育深度融合、创新高校实验教学改革、提升师资队伍建设水平。国内“双一流”建设高校更着重于通过虚拟仿真平台提高学生创新创业意识等方面研究虚实结合、科教融合、产教联合的实验实践教育教学体系建设，有力促进国内高校教学建设迈向国际化教学水平。

[参考文献]

[1] 李琳, 李晓曦, 毕欣芸, 等.  n-3多不饱和脂肪酸对NOD小鼠T细胞的免疫调节作用[J]. 南京医科大学学报 (自然科学版), 2019, 39(12): 1707-1711.

[2] 蔡新勇, 曾晖, 雷亮, 等. ω-3脂肪酸在急性心肌炎中的抗炎保护作用[J]. 江西医药, 2019, 54(10): 1204-1206+1210

[3] 刘志峰, 高小强, 于久翔, 等. 不同饵料对美洲西鲱仔鱼生长、相关酶活力及体脂肪酸的影响[J]. 中国水产科学, 2018, 25(1): 97-107.

[4] 王力, 杨舒婷, 焦建刚, 等. 三种水族馆珍贵鱼类的营养成分分析及脂肪酸营养评价[J]. 水产学报, 2019, 43(03): 618-627.

[5] 杨清源, 王少琴, 朱国平, 等. 西南大西洋拉氏南美南极鱼脂肪酸组成及其食性研究[J]. 大连海洋大学学报, 2017, 32(01): 86-92.

[6] 熊宏齐. 国家虚拟仿真实验教学项目的新时代教学特征[J]. 实验技术与管理, 2019, 36(9): 1–4.  

[7] 李震彪. 本科教学虚拟仿真实验之思考[J]. 实验技术与管理, 2019, 36(9): 5–7.

[8] 张春玲,胡松.海洋中尺度涡虚拟仿真实验设计[J].中国地质教育,2019,28(02):100-102.

[9]魏永亮,胡松,于潭,王家为.海洋水文气象调查与观测虚拟仿真建设及思考[J].教育教学论坛,2020(37):87-88.

[10]李平, 毛昌杰, 徐进. 开展国家级虚拟仿真实验教学中心建设提高高校实验教学信息化水平[J].实验室研究与探索, 2013 (11): 5-8.

 

The virtual simulation experiment of lipid extraction and methyl ester derivation of fish

WANG Shao-Qin^1,2    HU Song¹

(1.College of marine sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;

2.Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;

3.Experimental Teaching Demonstration Center for Marine Science and Technology, Shanghai Ocean University Shanghai 201306, China)

Abstract: The determination of fish fatty acid data plays an important role in studying fish nutrition and aquatic ecosystem. In view of the fact that a large number of repeated organic chemistry experiments in fish fatty acid experimental teaching will lead to a large amount of loss of experimental consumables and endanger the personal safety of students, the virtual simulation method is used to teach the operation process of fish fatty acid extraction and methyl esterification. By this way, we promote the combination of principle and operation,  enhance the students' interest, and improve the intuitive of practical operation.

Key words: virtual simulation; lipid extraction; lipid methyl ester esterification